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熒光定量服務


熒光定量PCR的基本原理就是在PCR擴增過程中，隨著PCR循環(huán)數(shù)的遞增，PCR產物不斷積累，熒光信號也會相應的增加，這樣就可以通過熒光強度的變化來對PCR反應進行實時的監(jiān)測，并以b-Actin或GAPDH等管架基因作為內參照，對目的基因的表達量進行半定量檢測。

科佰生物將根據(jù)您的科研需求可以提供SYBR Green染料法和TaqMan探針法。通過對DNA或RNA的熒光定量PCR監(jiān)測, 實現(xiàn)基因的相對定量、定量和定性分析。

SYBR Green熒光染料法：適用于任何DNA，無需設計探針，采取雙標準曲線法，實驗周期短，結果重復性好，靈敏度高。

TaqMan熒光探針法：經(jīng)驗豐富的實驗技術人員設計探針，對目標基因有高特異性，實驗重復性好，相對于SYBR Green法，靈敏度更高。

1.定量：

定量首先必須構建與檢測樣品目的基因具有相同序列的標準品。使用已知濃度的標準品制作3個點以上的標準曲線后，可以使用標準曲線對未知濃度的檢測樣品進行量（起始拷貝數(shù)）分析。

2.相對定量（mRNA表達量分析）：

基因表達的研究一般采用相對定量的方法。相對定量法必須對樣品的目的基因和參比基因內標同時分別進行定量，然后求出對于參比基因的目的基因的相對量。通過對樣品間的目的基因的相對量進行比較，可以對不同樣品間的mRNA進行表達量分析。參比基因通常選用表達量相對恒定的House Keeping Gene，如：GAPDH、b-actin等。通過同時對參比基因的實時檢測，可以對樣品之間由于起始細胞數(shù)不同、或RNA提取效率的不同等造成的RNA量誤差進行校正，達到在嚴格意義上對樣品之間的mRNA表達量進行分析之目的。

1、總 RNA 提取及定量；

2、PCR 引物設計及反轉錄；

3、熒光引物設計（SYBR Green 熒光染料法）/探針設計（TaqMan 熒光探針法)；

4、熒光定量PCR，進行擴增曲線、溶解曲線、表達量差異分析等實驗；

5、數(shù)據(jù)分析與處理；

6、完整實驗報告。

樣品要求：

1.樣品可提供組織、細胞、RNA、cDNA中的一種,對于提供樣本的大致原則如下：組織樣本,盡可能提供2×2×2mm3體積或以上,新鮮組織可直接提供，不需處理；對于細胞樣本，盡可能提供3×10^6個細胞左右,加適量Trizol處理即可，確保樣品適于RNA抽提。RNA、cDNA含量根據(jù)同等細胞數(shù)量的細胞抽提和逆轉錄大致界定, 如果提供RNA或cDNA我們要對您提供的材料進行評估。

2.客戶提供盡可能詳細的背景信息；物種信息，擴增目的基因的NCBI登錄號等。

3.運輸要求，液氮或干冰保存寄送。

注：樣本應避免各類污染和反復凍融。

提交的產品和資料：

1.RNA濃度及熒光定量PCR原始數(shù)據(jù)及分析結果；

2.熒光定量PCR完整的實驗步驟、使用儀器、軟件設置參數(shù)等。